Études de faisabilité de l'endoscopie non linéaire multimodale utilisant des faisceaux de fibres multicœurs pour l'analyse à distance depuis des coupes de tissus jusqu'aux organes en vrac

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 13779 (2023) Citer cet article

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Nous rapportons ici le développement et l'application d'une sonde compacte à fibre optique multicœur pour l'imagerie non linéaire multimodale, combinant les modalités sans étiquette de diffusion Raman anti-Stokes cohérente, de génération de seconde harmonique et de fluorescence excitée à deux photons. Les sondes de cette conception à fibre multicœur évitent les pièces mobiles et porteuses de tension à l'extrémité distale, offrant ainsi une compatibilité améliorée et prometteuse avec les exigences cliniques par rapport aux implémentations concurrentes. Les caractéristiques de performance de la sonde sont établies à l'aide de fines coupes cryogéniques et de cibles artificielles avant que l'applicabilité à des échantillons cliniquement pertinents ne soit évaluée à l'aide de tissus intestinaux humains et porcins en vrac ex vivo. Après reconstruction d'images pour contrecarrer la nature intrinsèquement pixellisée des données, les images enregistrées présentent une qualité d'image élevée et une conformité morphochimique au niveau des tissus par rapport aux images non linéaires multimodales obtenues avec un microscope à balayage laser utilisant un objectif de microscope standard. De plus, une procédure de reconstruction simple mais efficace est présentée et démontre qu'elle donne des résultats satisfaisants. Enfin, une voie claire pour des développements ultérieurs visant à faciliter la traduction de la sonde à fibre multimodale en évaluation et application cliniques dans le monde réel est décrite.

L’imagerie in vivo sans étiquette des tissus fournissant des informations à la fois morphologiques et chimiques est cruciale pour de nombreuses applications médicales envisagées, en particulier pour un examen histopathologique peropératoire non invasif des tissus. Au cours des dernières années, il a été démontré que la combinaison de différentes techniques spectroscopiques dans une approche d'imagerie multimodale est bénéfique pour répondre à toutes les exigences en matière de vitesse, de profondeur de pénétration et de spécificité moléculaire1,2,3. L’une de ces approches est la microscopie à diffusion Raman cohérente anti-Stokes (CARS), qui co-génère simultanément les deux autres effets non linéaires, la fluorescence excitée à deux photons (TPEF) et la génération de seconde harmonique (SHG), dans un seul dispositif d’imagerie. CARS permet de cartographier une vibration moléculaire spécifique, les plus fréquemment choisies indiquant principalement des lipides (par exemple, ~ 2855 cm−1, νs(CH2)) ou des protéines (par exemple, ~ 2930, νs(CH3)), qui sont tous deux sont abondants dans les échantillons biologiques. En revanche, le TPEF peut être utilisé pour traiter les auto-fluorophores endogènes, notamment le NAD(P)H, omniprésent dans les tissus en raison de son importance pour le métabolisme cellulaire. De plus, le SHG est un processus se produisant uniquement dans les matériaux non centrosymétriques, ce qui le rend très spécifique aux biomatériaux quasi cristallins comme les fibres de collagène ou les filaments de myosine. Ainsi, la combinaison de ces trois modalités non linéaires fournit des informations précieuses sur la morphochimie d’un tissu, sans étiquette.

Dans ce contexte, nous avons démontré que la microscopie multimodale non linéaire combinant CARS, SHG et TPEF permet la détection de structures caractéristiques et des changements moléculaires qui les accompagnent dans des maladies répandues, en particulier le cancer4,5. Pour faciliter l'interprétation des données d'image CARS/SHG/TPEF, des algorithmes avancés de traitement d'image peuvent extraire automatiquement les propriétés caractéristiques6,7. En outre, et parallèlement à l'évaluation automatique, il pourrait être démontré que les informations codées dans ces images multimodales enregistrées sans étiquette peuvent également être traduites en images informatiques d'hématoxyline et d'éosine (H&E)8 par des statistiques multivariées, qui exploitent non seulement le corpus existant de connaissances et formation des professionnels de la santé, mais pourrait également faciliter l’acceptation transitoire. Pour générer de telles images informatiques H&E et/ou pour fournir une évaluation automatisée de données d'imagerie non linéaires multimodales, y compris le classement de la maladie ou la segmentation visuelle comme base pour une prise de décision clinique ultérieure, sur site et directement pendant l'intervention chirurgicale, des dispositifs endoscopiques portatifs compacts sont requis. Avec des scénarios d'application allant de la détection des marges tumorales dans les plaies chirurgicales à l'investigation des symptômes et à la détection, au classement et à la surveillance des maladies dans les organes creux (par exemple, la maladie inflammatoire du bol9), le développement de dispositifs endoscopiques pour l'imagerie spectroscopique non linéaire a suscité un intérêt considérable. pendant de nombreuses années. Différentes approches ont été présentées : outre les sondes à balayage ponctuel10, les plus courantes sont les endoscopes à fibre à balayage11,12,13,14,15,16,17,18 et l'utilisation de miroirs à balayage galvo ou de scanners à système microélectromécanique (MEMS)19,20,21, 22,23,24.

90%) in the wavelength range of 400–780 nm. The GRIN lense and DOE assembly was manufactured to stricter tolerances, minimizing vignetting and chromatic errors of the pump and Stokes beams. Additionally, the probe head was refined with a new metal housing to protect and enforce the otherwise fragile fiber connection. For the same reason, Medical Device Regulation (MDR) approved endoscope tubes and SMA connectors were applied to the fibers. A home-built LSM has been used for coupling the excitation laser pulses generated by an 80 MHz mode-locked Nd:VAN laser (picoTRAIN, High Q Laser, Austria) in combination with an optical parametric oscillator (Levante Emerald, A.P.E, Germany) at 816 nm (pump) and 1064 nm (Stokes) into the imaging fiber34. This wavelength pair corresponds to a Raman resonance of 2850 cm−1, matching the symmetrical stretching vibration of CH2 groups particularly abundant in lipids, which results in a CARS signal at 661.8 nm. As excitation wavelength for the SHG modality, we used the 1064 nm beam, while both beams served as the excitation source for the TPEF modality. The proximal end of the imaging fiber is placed in the focal plane of the LSM where it is scanned by two galvo mirrors in a dense raster pattern, while the distal end of the probe is placed at the tissue sample. The full image circle diameter measures ~ 460 µm, however, a reduced scanning field (~ 260 µm) in the central region of the imaging fiber is used to avoid damaged cores in the fiber, which might have been caused during the manufacturing process of the probe head. The power of the laser beams at the sample site was about 50 mW for pump and 25 mW for Stokes in the probe measurement and 70 mW for pump, and 40 mW for Stokes in LSM recordings. The average laser power used for nonlinear endoscopic imaging provided sufficient signal generation from the presented samples without causing visible damage to any of them and aligns with the power scales utilized in comparable nonlinear endoscopic imaging applications18,35 with use of picosecond laser pulses. A useful point of reference in this context is provided by Galli et al.36 who investigated photodamage under similar excitation conditions as a function of recorded frame repetitions. A schematic setup of the LSM coupled to the probe is depicted in Fig. 1a. Figure 1b shows the internal optical design of the probe head. Two notch dichroic beamsplitters (NFD01-532 (Semrock, USA) and F73-067 (Chroma, USA)), and three bandpass filters (FF01-661/20 (Semrock, USA), FL532-10 (Thorlabs, USA) and FF01-550/88 (Semrock, USA)) were used in addition to a short-pass filter (FESH0700, Thorlabs, USA) to separate sample signals. In the current design iteration, all optics are designed for a measurement through 170 µm of glass. For easier prototyping and more versatility in the testing phase, the current design does not include a fixed glass window and instead relies on a cover glass to be placed on the sample. The probe design is largely agnostic to the specific LSM used and could, for example, be coupled with a compact fiber-based laser system and scan head to be incorporated into a mobile station, as demonstrated recently for a rigid-body nonlinear endoscope35. An overview of key structural and performance characteristics of the probe is given in Table 1./p>